為什么有的共定位圖片中葉綠體通道是玫紅色？
在擬南芥、、玉米、大麥、小麥等材料中，種植培養苗子時是正常接受光照的，葉片中含有大量葉綠體，而葉綠素在640nm左右的激發光下可產生紅色的自發熒光。當在這些含葉綠體較多的受體材料中做共定位實驗時，共定位marker一般為紅色熒光（在560nm左右的激發光下），實驗及共聚焦拍攝時兩個波長通道的熒光互不影響，但視野下看著比較混淆，尤其疊加后二者不易分清，因此只是在顏色顯示上將葉綠體自發熒光設置為玫紅色，以顯示和共定位marker的區別。
為什么有的基因定位結果與預想的不一致？
對于一個特定的定位載體，只要熒光表達較好，其定位結果是確定的，不會隨人為意愿或操作而改變。至于有時候和預想的結果不一樣，可能和蛋白本身、選擇的表達載體以及熒光蛋白融合方式等有關。
為什么有的普通定位結果出來后無法準確判斷其定位位置？
細胞中的細胞器復雜且多樣，除一些常見的、特征比較明顯的細胞器外，有些細胞器在激光共聚焦下形狀比較相似，例如：線粒體、過氧化物酶體、高爾基體等細胞器，它們的熒光表達形狀可能都是點狀，因此不易區分。這時可以結合基因的其他功能研究來判斷其可能表達的位置。另外，蛋白表達本身也是一個復雜的過程，涉及到多個合成場所及轉運過程，自身表達情況可能比較復雜，因此不易判斷具體的表達位置。
亞細胞定位操作步驟
1、通過一些在線網站預測亞細胞定位
2、亞細胞定位載體構建
（1）引物設計：利用引物設計軟件，根據pEGP-MCS-N1或pEGP-C1-MCS的酶切位點設計目的基因引物。
（2）載體構建：將PCR產物酶切后插入pEGP-MCS-N1或pEF-C1-MCS，得到表達目的基因與EGP融合蛋白質的真核表達載體。
3、細胞轉染
當細胞生長到對數生長期時，接種到共聚焦顯微鏡的玻璃底培養皿（35mm petri dish，10 mm Microwell）中，培養過夜。當細胞貼壁率達到30%~50%時，將融合綠色熒光蛋白GFP的重組載體質粒和目標細胞器質粒共轉染細胞。37℃孵箱培養24~72h。
4、激光掃描共聚焦顯微鏡觀察
將上述細胞分別在24、36、48、72h的時間點，根據實驗需求選擇對應激發波長（常用405nm、488nm和561nm），使用共聚焦顯微鏡觀察，采取圖像。
掃一掃手機網站
在線客服
15002786799
81680037@qq.com